DNA is a valuable source of information and more and more activities require techniques to analyze it. The Sensors & Biosensors Group works in the design of simple, fast and economic methods of detection of DNA, the genosensors. Their applications are multiple and allow to make agile processes like the detection of legionella, or to diagnose the risk of suffering certain diseases.

Article: Erdem, A; Pividori, MI; Del Valle, M; Alegret, S "Rigid Carbon Composites: a new transducing material for label-free electrochemical genosensing". Journal of electroanalytical chemistry, 567 (1): 29-37; jun 1 2004.

El diagnòstic del DNA s'ha convertit en un àrea d'importància creixent en bioquímica, medicina i estudis biotecnològics. La determinació de seqüències de DNA de persones, microorganismes i plantes té cada dia major rellevància en cada vegada més àrees d'interès. Els mètodes convencionals per l'anàlisi de DNA utilitzen dues variants importants, els que es basen en la seqüenciació i els que es basen en la hibridació.

Per desgracia, les metodologies clàssiques d'anàlisi de l DNA queden desfasades front la creixent demanda de més informació gènica, en menys temps i a un menor cost. Aquest és el context en que s'han desenvolupat les noves metodologies per l'anàlisi del DNA.

En paral·lel a l'anteriorment esmentat, el Projecte del Genoma Humà (PGH) ha contribuït en aquest repte científic per dues bandes. Per la primera, la informació generada i els resultats derivats del projecte Genoma ha obert nous mercats per a la demanda d'informació gènica, generant-se noves possibilitats d'anàlisi. En segon lloc, el projecte Genoma ha comportat l'establiment de metodologies analítiques capaces de subministrar informació gènica de manera ràpida i fiable.

El desenvolupament dels xips de DNA, unes plataformes en les que es porten a terme centenars o milers d'anàlisis de gens en paral·lel, és la mostra més clara de com aquesta evolució s'ha anat produint de forma simultània. Justament aquesta potència d'anàlisi, en que s'investiguen milers de gens en paral·lel els fa unes eines insubstituïbles en projectes ambiciosos, com desxifrar el codi genètic d'un organisme, però els limita per problemes analítics específics, com establir de forma ràpida i econòmica l'origen d'una contaminació microbiana.




En aquests moments hi ha una demanda clara d'anàlisis de DNA per part del nostre entorn, per exemple la indústria alimentaria, amb dispositius que no necessitin la supervisió professional, amb una operació simple i amb un cost reduït. Aquesta situació és la que ha portat al Grup de Sensors i Biosensors (GSB) de la Universitat Autònoma de Barcelona, concretament amb l'inici de la tesi doctoral de la investigadora Ma.Isabel Pividori, al desenvolupament de sistemes simples per l'anàlisi de DNA, els genosensors.

Un genosensor és un dispositiu per l'anàlisi gènica que combina un element de reconeixement biològic (una sonda de DNA), que es la que confereix la selectivitat, amb un transductor, que es qui atorga la sensibilitat i converteix l'esdeveniment de reconeixement (hibridació amb el DNA buscat) en un senyal electrònic mesurable. En essència, estem utilitzant la propietat que té el DNA per associar-se amb fragments complementaris, que és quan es forma la doble cadena, per donar el mecanisme responsable per al reconeixement. Quan diem que s'identifica un fragment de ADN, el que s'entén és l'ús d'un fragment de cadena simple - anomenat sonda - amb un codi complementari del fragment gènic que busquem, els quals hibriditzaran formant la doble cadena, essent aquest l'esdeveniment que indica el reconeixement.

El GSB ve dirigint alguna de les seves línies de recerca cap al desenvolupament de genosensors electroquímics robustos, d'ús simple i econòmics, dirigits a aplicacions en la indústria alimentaria i biotecnològica. Els genosensors desenvolupats tenen com característiques principals la seva capacitat de generar una resposta analítica en un curt lapse de temps, simplificant el procediment d'anàlisi i reduint el nombre d' etapes necessàries. Aquests assaigs gènics simplificats poden així ser realitzats fora del laboratori amb la utilització d'instrumentació portàtil.

Els dispositius desenvolupats resolen la irreversibilitat de les interaccions entre elèctrodes i DNA amb un procés de simple polit per tal de reutilitzar-los. Alternativament poden ser fabricats amb tècniques serigràfiques, el que abarateix el seu cost, permetent una utilització d'un sol ús. El senyal analític emprat es basa en l'oxidació selectiva del DNA a un potencial específic, oxidació que experimenten les seves bases nitrogenades guanina i adenina.

Aquesta mesura directa simplifica encara més el procés d'anàlisi, ja que no es requereix d'un pas addicional de marcatge, a diferència dels procediments habituals d'hibridització. Els dispositius desenvolupats han arribat a detectar femtomols de seqüències específiques de DNA.

Totes les característiques enunciades fan dels genosensors esmentats un dispositius amb evident interès comercial, ja que la seva construcció amb materials simples fa viable una transferència de tecnologia per una fabricació en sèrie de dispositius d'un sol ús en forma de kit genosensor. Algun exemple extrem d'aplicació potencial pot ser el de la identificació ràpida d'un focus d'infecció ambiental per Legionella, aplicació per la qual actualment es necessiten dies per tal de completar els resultats dels assaigs. En aquest temps, malauradament es produeixen noves infeccions estalviables de persones, ja que les metodologies emprades utilitzen mètodes biològics basats en cultius en medis específics, els quals necessiten d'almenys 48h per donar un resultat. Amb el kit genosensor que es dedueix de les investigacions esmentades, es podria obtenir un resultat aproximat en aproximadament 30 min.

Apart d'aquest exemple d'aplicació, amb els principis bàsics exposats ja han estat desenvolupats alguns exemples concrets, centrats en el diagnòstic alimentari. En col·laboració amb el Departament de Genètica i Microbiologia de la Universitat Autònoma de Barcelona, s'ha demostrat la validesa dels dispositius genosensors desenvolupats en la determinació de Salmonella. La detecció precoç d'aquest bacteri patogen es de capital importància en la indústria alimentaria, tant en les matèries primeres com en el producte acabat, ja que es un microorganisme responsable de greus brots de contaminació per aliments. El procediment total d'anàlisi és de 270 min (inclosa l'amplificació mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa), en contrast amb els entre 3 a 5 dies requerits per la seva determinació amb mètodes microbiològics clàssics. A més, el dispositiu genosensor desenvolupat pot ser emprat en diverses situacions - només cal dissenyar l'experiment amb la seqüència gènica del problema analític implicat -, en camps d'aplicació tan variats com el mèdic, biotecnològic de biologia molecular, determinacions forenses, mediambientals i especialment, industrials.

Però la detecció d'espècies bacterianes, encara que interessant des de punts de vista del diagnòstic clínic, el control alimentari o avaluació de riscos ambientals, és només un dels casos d'aplicació dels principis desenvolupats. Kits per la detecció ràpida de soques bacterianes de Campylobacter o Listeria, només per citar dues espècies també responsables d'episodis de contaminació alimentaria, només requeririen de la utilització de sondes de DNA apropiades, les seqüències de bases de les quals s'obtenen del coneixement genètic, actualment d'accés universal.

Exactament amb la mateixa tecnologia, només utilitzant una sonda de DNA adaptada al cas, es poden fer determinacions de gens o de individus amb procediments mes senzills i econòmics que els actuals. La determinació de gens està relacionada amb el diagnòstic primerenc de malalties transmissibles genèticament, com ho es la fibrosi quística, per exemple. En relació al diagnòstic de malalties que pot ser fet abans que s'hagin desenvolupat els seus efectes, pot basar-se la prevenció sanitària d'aquí a unes dècades. A partir d'un garbell d'uns centenars de variants de possibles malalties, tindríem la informació de la que podem patir, i per tant realitzar els canvis de dieta, costums o medicació que ho puguin prevenir.

Un segon cas de rabiosa actualitat en el que es necessiten mètodes ràpids i fiable per l'anàlisi de DNA, és en la identificació d'organismes modificats, si constitueixen o impurifiquen una partida de matèria primera alimentaria, o si estan presents en quantitats apreciables en aliments preparats. La postura que ha pres el consumidor europeu, en la que demana una informació fidel si els aliments porten algun organisme modificat genèticament per tal de poder decidir en consciència, no fa més que requerir de mètodes per obtenir informació gènica. En quant a la determinació d'identitats d'individus, es sabut el paper tant determinant que te actualment l'anàlisi de DNA, tant per establir relacions de parentela com per la cerca de proves judicials de comissió de delictes. De forma molt simplificada, l'anàlisi de DNA es basaria en la comparació entre dues persones de la presència d'un conjunt de determinats gens altament variables en la població , els quals, si estan tots presents asseguren una relació de parentela o de identitat per un individu determinat.

Per últim, la indústria farmacèutica també pot rebre aquesta tecnologia per fer estudis de toxicitat i avaluació del dany al DNA provocat per nous agents farmacològics en estudi, tant en el seu efecte sobre microorganismes patogens, com en l'avaluació de efectes secundaris sobre el pacient, amb un avantatge afegit important, el que es redueix al mínim l'experimentació animal implicada.

Manel del Valle Zafra
Departament of Chemistry
Universitat Autònoma de Barcelona